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Durante 1499, o Assassino Ezio Auditore da Firenze descobriu que a localização do Cofre estava na cidade de
Confronto no Vaticano
Roma, abaixo do Vaticano.

Descoberto esse desenvolvimento, membros dos Assassinos Italianos se prepararam para lutar contra a forte oposição e assassinar o inimigo de Ezio, Rodrigo Borgia, dentro do Vaticano para ganhar acesso ao lendário Cofre.

Lidando com os Templários responsáveis pela morte de seu pai e seus irmãos, Ezio assassinou os aliados de Rodrigo espalhados através da Itália, continuando sua jornada por Florença, Toscana, Forlí, Veneza e até a Espanha.

Com a morte de todos os seus seguidores, apenas o Grão-Mestre havia restado. Ezio viajou até o Vaticano para vingar a morte de seu pai e irmãos, confrontar Rodrigo e descobrir os segredos do Cofre.

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